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激光共聚焦显微镜的工作原理介绍

发布时间:2022-06-27      点击次数:222
   激光共聚焦显微镜是一种先进的细胞和分子生物学分析仪器,已被激光,电子照相机和计算机图像处理等现代高科技手段所渗透,并与传统的光学显微镜相结合。它以激光为光源,采用共轭聚焦原理和装置,并使用计算机对观察对象进行数字图像处理观察,分析和输出。它的特征是对样品进行断层扫描和成像,对细胞的三维结构进行非侵入式观察和分析。同时,使用免疫荧光标记和离子荧光标记探针,该技术不仅可以观察固定的细胞和组织切片,还可以实时动态观察和检测活细胞的结构,分子,离子和生命活动。它越来越多地用于生物学和医学领域,已经成为生物医学实验研究中重要的工具。
  激光共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”,进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析;还可以用于活细胞生理信号,离子含量的实时动态分析监测,粘附细胞的分选,细胞激光显微外科和光陷阱技术等。可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
  激光共聚焦显微镜的原理是用点光源照射试样,在焦平面上形成轮廓清晰的小光斑。光斑照射后发出的荧光被物镜收集,沿原照射光路送回由双向色镜组成的分光镜。光谱仪将荧光直接发送到检测器。光源和探测器前面有一个针孔,分别称为照明针孔和检测针孔。两者的几何尺寸相同,约100-200纳米;与焦平面上的光斑相比,两者是共轭的,即光斑可以通过一系列透镜同时聚焦在照明针孔和检测针孔上。这样,来自焦平面的光可以会聚在检测孔范围内,而来自焦平面上方或下方的散射光被阻挡在检测孔之外而无法成像。激光逐点扫描样本,检测到针孔后的光电倍增管也逐点获得相应光点的共焦图像,将其转化为数字信号传输至计算机。整个焦平面的清晰共焦图像聚集在屏幕上。
  每个焦平面图像实际上是样品的光学横截面,这种光学截面总是具有一定的厚度,也称为光学片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强,且非焦平面光被针孔过滤,因此共焦系统的景深近似为零。沿z轴扫描可实现光学断层扫描,并在待观察样品的焦斑处形成二维光学切片。将X-Y平面(焦平面)扫描与z轴(光轴)扫描相结合,将连续层次的二维图像进行累加,经专用计算机软件处理,即可得到样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦在同一点上,使得聚焦平面外激发的荧光无法进入检测针孔。
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