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激光共聚焦显微镜的基本观察步骤

发布时间:2022-09-01      点击次数:75
  激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本(例如细胞)进行观察时,来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于,每次只对空间上的一个点(焦点)进行成像,再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中,来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰,从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。
 
  样品制备是检测前的关键步骤,样品需要用荧光探针(单,双和三)标记。标本可以是固定的或活组织,或固定或活的贴壁培养。细胞应在共聚焦特殊培养皿或盖玻片,悬浮细胞,萼片或滴剂和盖玻片上培养,覆盖。样品厚度约1~2mm,盖玻片厚度应小于0.17mm,滑块厚度应在0.8~1.2mm之间,表面光滑,厚度均匀,并且没有明显的干扰荧光。固定样品通常用密封片密封,通常使用通过使用pH 8.5-9的PBS制备的甘油密封。
 
  根据实验要求制备样品完毕后。即可进行观察,基本步骤如下:
 
  (1)开启仪器电源及光源:一般先开启激光共聚焦显微镜和激光器,再启动计算机,然后启动操作软件,设置荧光样品的激发光波长,选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管检测器能得到足够的信号结果。
 
  (2)设置相应的扫描方式:在目视模式下.调整所用物镜放大倍数,在显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式,调整双孔针和激光强度参数,即可得到清晰的共聚焦图像。
 
  (3)获取图像:选择合适的图像分辨率,将样品完整扫描后,保存图像结果即可。
 
  (4)关闭仪器:仪器测定样品结束后,先关闭激光器部分,计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统,则应该在激光器关闭后,待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
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